Nitrospira – нитритокисляющие бактерии в аквариуме
Познавая теоретические основы своего хобби любой аквариумист рано или поздно узнает об азотном цикле...
Познавая теоретические основы своего хобби любой аквариумист рано или поздно узнает об азотном цикле. И, в связи с этим, о том, как описывают аквариумную нитрификацию уже более 30 лет в книгах и журналах, имеющих отношение к аквариумистике - бактерии рода Nitrosomonas (Nitrosomonas europaea) окисляют ам-миак до нитритов, а бактерии рода Nitrobacter (Nitrobacter winogradskyi) окисляют нитриты до нитратов.
Кроме того, такое представление об аквариумной нитрификации служило и служит основанием для произ-водства промышленных бактериальных добавок Nitrosomonas и Nitrobacter, предназначенных для ускорения установления азотного цикла в аквариумах.
Действительно, бактерии родов Nitrosomonas и Nitrobacter являются нитрифицирующими. Однако, научных доказательств их решающей роли именно в аквариумной нитрификации никогда не было. Каким же образом родилась эта догма аквариумистики?
Исследования нитрифицирующих бактерий проводились, в основном, для установок обработки сточных вод, где доминирующими нитрификаторами считали представителей родов Nitrosomonas и Nitrobacter. Предполагалось, что они же должны доминировать и в других водных средах, содержа-щих предпочитаемый этими бактериями субстрат – то есть, и в аквариумах. Причем, строгих науч-ных доказательств доминирования Nitrosomonas и Nitrobacter в установках обработки сточных вод не было. Образцы из таких установок культивировали в лабораториях на обогащенных средах, а затем оценивали – какие бактерии преобладают количественно в выращенной культуре. Точность методов идентификации бактерий оставляла желать лучшего. К тому же, выяснилось, что культивирование в лабораторных условиях оказывает селекционное влияние на отдельные виды бактерий, в частности на Nitrosomonas europaea. Другими словами, клетки Nitrosomonas europaea численно доминируют в лабораторном сосуде, хотя другой вид бактерий доминирует в той среде, откуда был взят образец.
Исследования нитрификации в аквариумных средах начались гораздо позже. Среди них преобладали изучения изменения концентраций аммиака, нитритов и нитратов в зависимости от различных пара-метров, без определения и количественной оценки видового состава бактериального сообщества.
Таким образом, утверждение о доминирующей роли Nitrosomonas и Nitrobacter в аквариумах было, по сути, теоретическим предположением, сделанным на основе неточных и искаженных результатов исследований установок сточных вод.
Тем не менее, завеса тайны над аквариумной нитрификацией была приоткрыта благодаря применению в исследованиях современных методов молекулярной биологии, которые позволяют с высокой точностью определять и количественно оценивать видовой состав бактериальных сообществ. Некоторую роль сыграли также случайные стечения обстоятельств.
В 1990 г. ученый-биолог Тимоти Хованек организовал лабораторию для изучения разнообразных аспектов аквариумной химии и биологии, в том числе - эффективности различных систем биофильтрации. Для этого потребовалось изучение бактериальных сообществ в аквариумах. До этого научная работа Хованека была, в основном, связана с исследованием рыб. Потому ему было привычно, что количественный подсчет изучаемых объектов не вызывает проблем. По его собственному признанию в интервью, когда он изучал научную литературу, составляя план исследований лаборатории, его просто поверг в шок тот факт, что при исследовании аквариумных нитрификаторов не применяются методы количественной оценки бактерий. Он решил разработать такие методики. Он не собирался выяснять, кто осуществляет нитрификацию в аквариумах. Он просто планировал оценивать в разных условиях количество тех бактерий, которых уже более 30 лет в литературе называли аквариумными нитрификаторами - Nitrosomonas europaea и Nitrobacter winogradskyi.
На одной из конференций Хованек ознакомился с успехами в изучении происхождения и родственных связей цихлид, достигнутыми благодаря анализу ДНК рыб. Затем он выяснил, что один из ведущих специалистов в области изучения бактерий при помощи аналогичных методов – профессор Эдвард де Лонг (Edward DeLong) - возглавил одну из лабораторий в Калифорнийском университете. В лаборатории де Лонга Хованек освоил современные молекулярные методы исследования бактерий. Затем, уже в своей лаборатории, он разработал методики, с помощью которых намеревался оценивать количественные изменения Nitrosomonas europaea и Nitrobacter winogradskyi в аквариумных фильтрах. И приступил к исследованиям.
Его сразу же постигла «неудача». Современные высокоточные методы почему-то не обнаруживали Nitrobacter winogradskyi ни в одном аквариуме. Nitrosomonas europaea не обнаруживались в пресноводных аквариумах, и присутствовали, но не доминировали в морских аквариумах. В то же время изменения концентраций аммиака, нитритов и нитратов свидетельствовали, что нитрификация в аквариумах происходит. Хованек повторял эксперименты многократно - более года. Результаты были все те же. Так, задача количественной оценки Nitrosomonas europaea и Nitrobacter winogradskyi была снята с повестки дня. Стало очевидно, что прежде, чем оценивать количество нитрифицирующих бактерий, следует выяснить - а какие именно бактерии осуществляет нитрифицию в аквариуме.
Сперва Хованек решил сосредоточить внимание на нитрит-окисляющих бактериях. При помощи методов молекулярной биологии он установил, что окисление нитритов в пресноводных и морских аквариумах осуществляют бактерии рода Nitrospira. До этого считалось, что эти бактерии не играют существенной роли в нитрификации в водных средах.
Хованек неоднократно повторил исследования на образцах из фильтров и грунта пресноводных и морских аквариумов с различными количествами рыб и с моделированием динамики содержания аммиака посредством добавления хлорида аммония. Во всех случаях обнаруживались в доминирующих количествах нитрит-окисляющие бактерии Nitrospira. Бактерии Nitrobacter не обнаруживались ни в одном случае. Хованек установил, что появление бактерий Nitrospira в определяемых количествах происходило с 12 по 22 день после запуска аквариума. Их появление и изменение количества соответствовало динамике окисления нитритов до нитратов.
Также Хованек исследовал влияние промышленных бактериальных препаратов, содержащих Nitrosomonas europaea и Nitrobacter winogradskyi и предназначенных для ускорения установления азотного цикла. Бактериальные добавки не ускоряли установление нитрификации и не изменяли состав бактериального сообщества по сравнению с контрольными аквариумами. А концентрации нитритов и аммиака все равно достигали токсичных уровней. Несмотря на добавление препаратов, содержащих Nitrobacter winogradskyi, эти бактерии не могли заселиться в пресноводных и морских аквариумах в определяемых количествах. При добавлении препаратов Nitrosomonas europaea, бактериальная картина также не изменялась. Полезным эффектом применения бактериальной добавки было более быстрое увеличение количества бактерий Nitrospira. Оценить, насколько этот эффект был существенным, было невозможно из-за недостаточности данных. Хованек высказал предположение, что эффект мог быть обусловлен влиянием питательных веществ в добавках.
Примерно в это же время три другие исследовательские группы (одна в Австралии и две в Германии) опубликовали результаты исследований, показывающие, что Nitrospira-подобные бактерии, а не бактерии рода Nitrobacter ответственны за нитрификацию во многих различных типах аквариумных систем.
Таким образом, Хованеком была открыта роль нитрит-окисляющих бактерий Nitrospira в аквариумах. Исследования длились около пяти лет. За это время в научной литературе появились работы других исследователей, которые демонстрировали, что Nitrospira-подобные бактерии являются доминирующими нитрит-окислителями и в установках по обработке сточных вод.
Эти исследования также показали, что выводы о доминирующей роли бактерий Nitrosomonas europaea в окислении аммиака ошибочны. Использование методов молекулярной биологии позволило выяснить, что в установках по переработке сточных вод преобладают, в основном, 3 группы аммиак-окисляющих бактерий. Бактерии, родственные Nitrosomonas europaea; Nitrosococcus mobilis и родственные бактерии; и третья группа – не-известные бактерии, которые не удалось идентифицировать и культивировать. Численно преобладающими оказались бактерии Nitrosococcus mobilis.
Хованек продолжил исследования. Следующей задачей стало исследование аммиак-окисляющих бактерий. Полученные к настоящему времени результаты таковы. В бактериальных сообществах фильтров пресноводных аквариумов преобладают аммиак-окисляющие бактерии, близкородственные Nitrosomonas marina. В морских аквариумах виды Nitrosomonas составляют около 20% состава бактериальных сообществ. Исследования в на-стоящее время продолжаются.
В связи с открытием ключевой роли бактерий Nitrospira в окислении нитритов в различных средах в Университете Вены создан международный проект по изучению этих бактерий. Среди основных целей исследований - секвенирование генома этих бактерий, изучение их особенностей нитрит-окисляющих механизмов и взаимо-действия с другими бактериями.
Для аквариумиста важно знать, какие именно бактерии в являются нитрит-окисляющими и аммиак-окисляющими в аквариумах. Это необходимо, чтобы грамотно решить вопрос о целесообразности применения бактериальных препаратов, а также, чтобы разумно подойти к выбору такого препарата. Зная, какие бактерии осуществляют процесс, а следовательно, зная особенности биохимии и физиологии этих бактерий, можно поддерживать условия, благоприятные для максимально эффективной биофильтрации, и устранять возникающие проблемы. Например, одна из распространенных проблем – значительно затянувшийся период токсичных концентраций нитритов. Изучив особенности жизнедеятельности нитрит-окисляющих аквариумных бактерий, можно понять, какие обстоятельства ингибируют их рост, и как решить эту проблему.
К сожалению, достоверных повторяемых научных данных о бактериальных сообществах в аквариумах в на-стоящее время крайне недостаточно. Огромная часть того, что написано в популярной аквариумной литературе, представляет собой теоретические предположения или основано на результатах старых исследований, выполненных еще до начала применения высокоточных методов молекулярной биологии. Поэтому, весьма вероятно, что очень многое будет пересмотрено. Как это и произошло с аквариумными нитрифицирующими бактериями.
Методы, использованные Хованеком в исследованиях. Выделение бактериальной ДНК из аквариумных образцов. Определение и количественная оценка видового состава бактериальных сообществ в образцах на основе анализа выделенной ДНК (секвенирование и клонирование ДНК; применение молекулярных зондов, специфичных для определенных видов бактерий; электрофорез в градиенте денатурирующего агента DGGE; амплификация фрагментов полученного генетического материала с использованием полимеразной цепной реакции PCR и др.). Подробнее о методах исследований можно узнать из научных работ Хованека (см. список литературы).
Тимоти Хованек (Dr. Timothy A. Hovanec, Ph.D) - научный руководитель «Aquaria Inc.». Консультант част-ных и правительственных контрактов по установкам аквакультуры в нескольких странах. Автор нескольких патентов. По образованию – биолог (Государственный университет San Diego, где он получил научные степени B.S. и M.S.), научную степень Ph.D. получил в 1998 г., защитив диссертацию в Калифорнийском университете.
Бактерии рода Nitrospira.
Грамотрицательные, хемолитоавтотрофные нитритокисляющие бактерии. Облигатные аэробы. Обнаруживаются в пресных и соленых водах, донных отложениях, почвах, нагревательных установках, установках обработки сточных вод, установках аквакультуры и аквариумах. Используют в качестве источника углерода неорганический углерод (HCO3- и CO2), а также способны использовать пируват в аэробных условиях. По данным некоторых исследований определенные концентрации доступного органического углерода в среде могут благоприятно влиять на рост этих бактерий. Рост ингибируется при концентрации органических веществ 0.75 г/л и выше. Время удвоения популяции - 12 - 32 ч. Оптимальные условия роста в минеральной среде - 39 0 C, pH 7.6-8.0, концентрация нитритов - 0.35 mM. В настоящее время в научной литературе бактерии Nitrospira считаются доминирующими нитрит-окисляющими бактериями в водных средах. Идентифицировано и охарактеризовано два вида - Nitrospira marina и Nitrospira moscoviensis.
Большое разнообразие и широкая распространенность в естественных и искусственных средах свидетельствуют, что эти нитритокисляющие бактерии весьма конкурентноспособны, имеют высокую адаптируемость и играют ключевые роли а азотном цикле многих экосистем.
Источник: aguarium.info